常见问题

Q: 什么是蛋白表达和纯化？

蛋白表达是一种生物技术过程，用于产生特定的蛋白质。它可以在原核生物、真核生物或体外大肠杆菌表达系统中进行。蛋白纯化是一系列旨在从细胞或生物体中分离出一个或几个蛋白质的过程。蛋白质纯化的最常用方法是亲和层析，它通过不同的蛋白质标签进行设计。其他蛋白质纯化方法包括离子交换层析、分子排阻层析、抛光纯化和疏水相互作用层析，可用于处理高纯度的无标签蛋白质。

Q: 蛋白质是如何纯化的？纯度是否有保证？

根据融合蛋白的标签类型和蛋白质本身的理化特性设计最佳纯化方案。常用的纯化方法包括：亲和层析、疏水层析、离子交换层析、分子筛、盐析等。我们保证的最低纯度标准为〉85%。如果初始纯化未达到此标准或客户有更高的纯度要求，我们还拥有AKATA纯化仪器，该仪器高度自动化、精确控制，结合使用各种柱子，确保我们的蛋白质产品的纯度进一步提高，并在COA报告上显示最终纯度测试结果。

虽然我们保证的最低纯度标准为>85%，但我们制备的一些蛋白质的纯度达到了95%甚至97%。

Q: 为什么没有或蛋白表达量很低？

可能存在的原因有：

a. 向量构建错误。您应该通过测序确认向量或申请定制克隆服务。

b. 稀有密码子。你应该优化密码子，使用补充稀有密码子的菌株，在较低的温度下诱导

c. 蛋白质毒性。您应该使用调控更严格的启动子或较低的质粒拷贝数。在基于T7系统的菌株中使用pLysS/pLysE菌株，或者选择更适合表达毒性蛋白质的菌株。在高OD值下开始诱导并缩短诱导时间。在使用含有Lac启动子的表达载体时添加葡萄糖。

Q: 如何表达具有生物活性的蛋白质？为什么蛋白质无活性？

为了获得具有生物活性的蛋白质，您应选择正确的表达系统、适当地表达载体、合适的纯化方法以及验证实验。此外，您还可以检查以下问题：

a. 蛋白质的溶解度较低。您可以将所需的蛋白质与融合伴侣融合，并降低温度。

b. 缺乏必要的翻译后修饰。您应选择另一个表达系统。

c. 折叠不完整。您应使用融合伴侣，并使用具有冷适应分子伴侣的菌株。在较低温度下与分子伴侣共同表达。监测二硫键的形成，并允许进一步的体外折叠。

d. cDNA中的突变。您应在诱导前后测序质粒，或使用recA－菌株确保质粒的稳定性。在每次表达循环前转化大肠杆菌。

Q: 如何避免包涵体的形成并改善可溶性表达？

a. 高亲水性或跨膜结构的蛋白质。您应该添加融合标签或加入热休克分子伴侣。在低温下较短时间诱导表达，或者转换至贫负载培养基。产生截短形式的蛋白质或使用富含膜的菌株。

b. 错误的二硫键形成。您应该添加融合伴侣蛋白，包括巯基还原酶、DsbA和DsbC。克隆到含有分泌信号肽的质粒中，使其分泌到细胞外腔。使用具有氧化型胞质环境的gamiB (DE3）菌株。降低诱导剂浓度和诱导温度。

c. 错误的折叠。您应该使用融合伴侣蛋白。与分子伴侣一同共表达。使用具有冷适应分子伴侣的菌株。向培养基中添加化学分子伴侣和辅因子。降低诱导剂浓度并添加新鲜培养基。在低温下较短时间诱导表达。

Q: 为什么蛋白质的分子量小于预测值？

可能存在的原因有：

a. 蛋白质序列中包含罕见的氨基酸硒蛋白质（Sec）或吡咯赖氨酸（Pyl）。您应该使用其他氨基酸来代替这两种不常见的氨基酸。

b. 融合蛋白质的翻译过程不平衡。您应该更换其他的融合标签或将融合标签移到C端。在低温下较短时间诱导表达，或者转换至贫负载培养基。

c. 蛋白质降解。您应该替换特定的蛋白酶位点。使用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下诱导表达。在低温下较短时间诱导表达，或者在破碎细胞时使用蛋白酶抑制剂。

Q: 为什么实际的带状大小与预测值不同？

可能存在的原因有：

a. 翻译后修饰。如磷酸化、糖基化等会增加蛋白质的大小。

b. 翻译后剪切。许多蛋白质首先合成为前蛋白质，然后通过剪切产生活性形式。

c. 剪接变体。剪接变异可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

d. 相对电荷。氨基酸的组成具有不同的相对电荷，这会影响电泳迁移性。

e. 多聚体，例如蛋白质的二聚化。通常在还原条件下会被阻止，尽管强烈的相互作用可能会导致出现较高的带状。

f. 蛋白质结构，如二硫键、蛋白质二级结构或蛋白质三维结构形成。

g. 疏水性蛋白质，如跨膜蛋白质，可能难以迁移到凝胶中，从而导致不同的多带图案。

Q: 给定的标签类型会对蛋白质的生物活性产生什么影响？

从理论上讲，小的标签对蛋白质活性影响很小。然而，具体对蛋白质活性的影响无法一概而论（有些蛋白质没有影响，有些蛋白质有轻微影响，而有些蛋白质可能有较大影响）。

Q：中朊生物可以表达酶吗？
A: qBac®杆状病毒/昆虫细胞表达系统非常擅长酶的表达，通常表达出的酶具有天然的结构、有效的活性和极高的产量，适于各类下游应用场景。通常酶的纯化过程在低温下进行，还会添加蛋白酶抑制剂，以确保其蛋白活性和得率。

Q：中朊生物可以表达膜蛋白吗？
A: 中朊生物具有成功表达（多次跨膜）膜蛋白的案例，然而，膜蛋白的表达纯化是生物医学界的痛点问题，具有一定的困难。一般情况下，膜蛋白的胞内结构域（inner domain）或胞外结构域（outer domain）具有特定的功能，中朊生物通常推荐只表达膜蛋白的胞内结构域（inner domain）或胞外结构域（outer domain），这和普通的蛋白表达策略是一致的。若需要同时表达膜蛋白的胞内结构域和胞外结构域，基于蛋白的生物物理特性，可以考虑将跨膜结构域（transmembrane domain，TM domain）截断或替换为其他柔性多肽（如n×G4S）。另外，杆状病毒/昆虫细胞表达系统擅长全长膜蛋白的表达，但其后期纯化需要客户花费相当的时间和精力去充分试验。

Q：中朊生物可以表达大分子量蛋白吗？
A: 大分子量蛋白通常难以表达，在表达后也容易发生降解。但大量的科研和工业实践表明：杆状病毒/昆虫细胞表达非常适合表达大分子量蛋白。中朊生物拥有丰富的大分子量蛋白的表达经验，成熟的技术平台能够为客户提供该项服务。

Q：中朊生物表达的蛋白可以组装成病毒样颗粒 (Virus-likeParticles，VLP)吗？
A: 病毒样颗粒(VLP)为病毒单一或多个结构蛋白自我组装形成的高度结构化蛋白颗粒，VLP不含有病毒的遗传物质且在形态结构上与天然病毒具有高度相似性，因此具有较高的安全性、较强的免疫原性、特异性及生物活性。VLP的组装依赖蛋白自身的组装，中朊生物提供的技术服务中，较高的蛋白表达量能够促进重组蛋白在胞内或培养基中发生自组装，更大概率促进VLP结构的构筑。

Q：中朊生物表达的蛋白具有翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs)）吗？存在糖基化修饰吗？
A: 杆状病毒/昆虫细胞表达系统，能够对表达出的蛋白进行翻译后修饰（PTMs）。糖基化作为典型的翻译后修饰类型，存在于重组蛋白中。然而，昆虫细胞的糖基化和哺乳动物的糖基化稍有不同，主要体现在哺乳动物细胞合成的糖蛋白含有唾液酸末端的杂合型N－糖链，而昆虫细胞表达的蛋白糖链仅包含数个寡糖类（甘露糖或海藻糖等），其形成的糖蛋白可能会导致过敏反应。对于解决昆虫细胞糖基化修饰缺陷的问题，中朊生物采用Mimic Sf9细胞，使制备出的糖蛋白具有更完整的N-糖基化途径，在含有血清的培养液中能够表达出人源化的重组糖蛋白。

Q：中朊生物可以利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统，同时表达多个重组蛋白吗？ 
A: 中朊生物可以利用qBac®杆状病毒/昆虫细胞表达系统同时表达多个蛋白。有以下策略可供选择（1）多个蛋白的基因（CDS编码区）分别整合到多个杆状病毒基因组中，通过杆状病毒的共感染，使昆虫细胞同时表达多个重组蛋白；（2）将多个蛋白的基因整合到同一个杆状病毒基因组中，通过杆状病毒最强的两个启动子（polh promoter和p10 promoter）来调控目的蛋白的表达。这种策略通常用来同时表达两个不同的重组蛋白；（3）采用更加精巧复杂的策略，确保多个蛋白的基因整合到同一个杆状病毒基因组中，使得多个蛋白同时表达并维持其天然功能，详情请对接CRO业务。

Q：中朊生物提供哪些纯化策略？亲和层析中His标签放在N端还是C端？
A: 目前，中朊生物目前主要提供亲和层析的纯化策略。
亲和层析中，His标签因其分子量较小，后期纯化便捷，低成本等特点被广泛使用。His标签的位置取决于重组蛋白的特性及下游应用需求，若蛋白大小适中且标签不影响后续试验，N端和C端均可；若目的蛋白较小，为延缓降解，通常建议放在C端；若后续需要切割标签，为避免氨基酸残基的切割不完全，通常建议放在N端。

Q：中朊生物提供无标签蛋白表达和纯化的服务吗？
A: 中朊生物采用的qBac®杆状病毒/昆虫细胞表达系统能够大量表达重组蛋白，若使用分泌策略，可于培养液上清中获得较高纯度的重组蛋白。然而并非所有蛋白均可以实现上述情况，故通常建议添加不影响蛋白功能的小标签（His tag）便于后期蛋白纯化。

Q：中朊生物如何测定蛋白浓度和纯度？
A: 中朊生物通常采用A280(nm)紫外光吸收法和Bradford法来测定蛋白浓度，分析SDS-PAGE中蛋白条带的灰度来测定蛋白纯度。

Q：中朊生物表达的蛋白一定可溶吗？不可溶蛋白是否可以进行变性复性？
A: 通常情况下，昆虫细胞因其自身优势，表达出的蛋白是可溶的，所以我们一般不对其进行变性复性操作。中朊生物通常会在前期根据客户需求，尽可能设计科学合理的方案来表达目的蛋白，通过审慎地进行密码子优化、推荐性能卓越的信号肽和启动子、设计合理的纯化标签、选取最优的表达方式等策略来进行重组蛋白的制备。理论上不可溶蛋白可以通过变性再复性过程提高可溶性，但中朊生物通常不提供该项服务。

Q：中朊生物是否接受客户提供杆状病毒的订单？
A: 中朊生物拥有独家授权的qBac®杆状病毒/昆虫细胞表达系统，提供杆状病毒/昆虫细胞表达系统的定制蛋白服务。qBac®杆状病毒/昆虫细胞表达系统具有卓越的性能，适于各类蛋白的表达和制备，而其他类型的杆状病毒表达系统可能会导致不可预估的风险，故中朊生物不接受客户提供杆状病毒的订单。