MST（微量热泳动）
MST技术简介
微量热泳动(MicroScale Thermophoresis,MST)技术基于热泳动现象和荧光检测原理，通过分析分子在温度梯度场中的迁移行为变化来测定互作强度。该技术利用红外激光在样品溶液中产生局部温度梯度，不同分子因其尺寸、水化层及表面电荷的差异，在温度梯度中表现出不同的定向迁移行为（热泳动）。将互作分子之一（Target）进行荧光标记，当它与另一分子（Ligand）结合形成复合物时，其物理化学性质的改变会导致热泳动速度变化。通过检测荧光强度的变化，系统可精确计算解离常数（KD）。
MST的显著特点是其超微量样品需求和溶液内检测环境。该技术仅需微量样品（低至5μL），可在接近生理条件下直接检测溶液中的互作，避免了固定化可能导致的构象改变。2024年复旦大学团队利用MST研究维生素B转运机制时，发现维生素B1在pH 6.0时与转运蛋白SLC19A2的亲和力（78.4 μM）显著高于pH 7.5时的亲和力（153.7 μM），揭示了转运过程受pH调节的分子机制4。MST还可检测嵌入脂质体或纳米盘中的膜蛋白相互作用，为膜蛋白研究提供了有力工具。
MST是基于Monolith仪器检测分子互作，待检测的互作生物分子可以是蛋白-抗体，蛋白-蛋白，蛋白-DNA/RNA蛋白-小分子化合物等。
MST的优势
MST热泳动检测基本原理
将其中一个互作分子（大多是蛋白）标记荧光染料或者融合GFP标签，将标记蛋白和配体分子按照特定的浓度梯度置于毛细管中，红外激光加热产生一个微观的温度梯度场发生热泳动，其水化层、分子大小、电荷等分子性质会随着热泳动发生改变，进而引起反应体系中荧光分布的变化。MST除了能精确检测生物分子间相互作用，通过计算解离常数(Kds),还能得到有关生物分子互作的其他参数，实现精确的定性分析。
MST检测信号
初始阶段，溶液中的分子均匀分布，并检测这一阶段的荧光值。红外线开启后立刻出现脉冲
升温，由于温度的快速改变，荧光团的分布也发生改变。随后，荧光分子远离红外线加热的区域。红外线开启30s时出现典型的荧光变化。关闭红外线后，发生逆向的T-jup，反应体系恢复均匀分布的状态。
结合曲线
荧光标记的分子（黑色曲线表示未结合）与未标记的配体结合后改变其自身的热泳动（红色
曲线表示结合)，产生不同的检测曲线。用标准化的荧光值△Fnorm(△Fnorm=Fhot/Fcold.)表
示分子热泳动的变化(F值指粉色和蓝色光标所标注区间内的平均荧光值)。不同毛细管中逐渐增加未标记荧光的配体浓度，会产生不同热泳动检测信号，利用△Fnorm绘制出结合曲线。
案例介绍
(1)验证蛋白与离子结合
MST技术检测蛋白与钙离子互作（小麦）
山东大学生命科学学院刘树伟教授课题组在国际学术期刊《Molecular Plant》(一区：IF17.1)发表了题为“Ca2+-dependent TaCCD1 cooperates with TaSAUR215 to enhance plasma membrane H+-ATPase activity and alkali stress tolerance by inhibiting PP2C-mediated dephosphorylation of TaHA2 in wheat”的研究论文。该论文首次解析了钙离子结合蛋白TaCCD1通过与生长素早期响应蛋白TaSAUR215互作抑制TaPP2C.D1/8的磷酸酶活性从而调控细胞质膜（PM）H+-ATPase的磷酸化水平以促进小麦耐碱性的分子机制，为小麦抗碱育种改良提供了理论依据和基因资源。
为了揭示SR4耐碱的分子机制，作者进一步研究发现钙离子信号在SR4耐碱中发挥重要作用。在碱胁迫下，TaCCD1在SR4的根中被特异性诱导，但在JN177的根中几乎不受碱胁迫的影响(图2A)，其在小麦中过量表达能够促进PM H+-ATPase活性并增强小麦对于碱胁迫的耐受性。作者利用微量热泳动技术（MST）发现TaCCD1能够结合Ca2+，并发现TaCCD1能够结合Ca2+（图2B）。而且在Ca2+存在下，TaCCD1可以与苯基琼脂糖凝胶结合；当向缓冲液中添加钙离子螯合剂（EGTA）时，TaCCD1从苯基琼脂糖凝胶柱中洗脱，表明TaCCD1与苯基琼脂糖凝胶的相互作用依赖于Ca2+结合（图2C）。为了进一步验证TaCCD1能够结合Ca2+，该研究对TaCCD1-谷胱甘肽巯基转移酶 (GST）进行实验发现，荧光强度随蛋白质浓度的增加而降低，表明上清液中的游离Ca2+可以与TaCCD1-GST结合（图2D）。然而，添加TaCCD1（D84A/D86A/D88A/E95A）突变蛋白，并没有降低上清液中的荧光强度，这表明TaCCD1-GST蛋白结合Ca2+需要这四个残基（图2D）。
(2)模拟体内蛋白-蛋白结合对比实验
实验目的：验证X与野生型YWT，X与突变型YMu两组蛋白的结合能力差异情况。
实验方法：将X蛋白作为配体蛋白，Y蛋白作为受体蛋白，用原核重组表达（体外结合）和过表达转染细胞（半体内）两种方式，使用MST技术，检测解离常数。
实验结论：突变的产生导致X与Y蛋白的亲和力明显下降，说明结合能力减弱，体内体外数据一致。
参考文献：
A synergetic effect of BARD1 mutations on tumorigenesis Nature Communications(2021)
